磷脂酰絲氨酸發(fā)酵過(guò)程中的代謝流分析與關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)調(diào)控

磷脂酰絲氨酸（PS）的微生物發(fā)酵合成以“磷脂酰乙醇胺（PE）為前體，經(jīng)磷脂酰絲氨酸合成酶（PSS）催化的堿基交換反應(yīng)”為核心代謝路徑，代謝流分析需聚焦“碳源分配、前體供給、輔酶再生、產(chǎn)物外排”四大關(guān)鍵模塊，通過(guò)調(diào)控節(jié)點(diǎn)平衡代謝flux，實(shí)現(xiàn)磷脂酰絲氨酸高效合成。以下是詳細(xì)的代謝流解析與關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)調(diào)控策略：

一、磷脂酰絲氨酸發(fā)酵核心代謝流路徑解析

1. 碳源代謝流：能量與碳骨架供給通路

核心路徑：葡萄糖/甘油等碳源經(jīng)EMP途徑、TCA循環(huán)生成丙酮酸、乙酰輔酶A，一方面為細(xì)胞生長(zhǎng)提供ATP與NADH，另一方面為磷脂合成提供脂肪酸鏈（乙酰輔酶A經(jīng)脂肪酸合成酶系合成C16/C18脂肪酸）和甘油骨架（磷酸二羥丙酮還原生成3-磷酸甘油）。

代謝流分配特征：發(fā)酵前期（0~12h），80%以上碳源流向細(xì)胞生長(zhǎng)（蛋白質(zhì)、核酸合成）；中期（12~48h），碳源向磷脂合成傾斜，約40%~50%流向PE/PS合成，30%維持能量代謝；后期（48h后），碳源代謝流下降，需避免流向副產(chǎn)物（如乙酸、乳酸）積累。

2. 前體合成代謝流：PE的定向生成通路

PE合成兩條關(guān)鍵路徑：

路徑1（從頭合成）：3-磷酸甘油→磷脂酸（PA）→胞苷二磷酸甘油二酯（CDP-DAG）→磷脂酰甘油（PG）→PE，該路徑依賴CTP（胞苷三磷酸）供能，關(guān)鍵酶為CDP-DAG合成酶（CdsA）、磷脂酰甘油磷酸合成酶（PgsA）；

路徑2（補(bǔ)救合成）：外源乙醇胺經(jīng)乙醇胺激酶磷酸化生成磷酸乙醇胺，與CDP-DAG反應(yīng)生成PE，關(guān)鍵酶為乙醇胺激酶（EtnK），該路徑更直接，代謝能耗低，是工業(yè)發(fā)酵優(yōu)先強(qiáng)化的流路。

代謝流瓶頸：CTP供給不足、CdsA酶活性有限，導(dǎo)致CDP-DAG積累不足，限制PE合成，進(jìn)而影響磷脂酰絲氨酸前體供給。

3. 目標(biāo)產(chǎn)物合成流：磷脂酰絲氨酸的定向轉(zhuǎn)化通路

核心反應(yīng)：PE+L-絲氨酸 → PS+乙醇胺（PSS催化，依賴Mg²⁺作為輔酶），該反應(yīng)為可逆反應(yīng)，需維持L-絲氨酸過(guò)量以推動(dòng)代謝流向PS傾斜。

代謝流特征：PSS酶的底物特異性決定了PE向PS的轉(zhuǎn)化效率，野生菌株中該路徑代謝流較弱（PS轉(zhuǎn)化率＜30%），需通過(guò)異源表達(dá)PSS或強(qiáng)化酶活性提升flux。

4. 副產(chǎn)物代謝流：無(wú)效消耗的控制通路

主要副產(chǎn)物：乙酸（TCA循環(huán)溢流代謝）、乳酸（厭氧代謝支路）、磷脂酰膽堿（PC，PE甲基化產(chǎn)物）、游離脂肪酸（磷脂降解產(chǎn)物）。

代謝流浪費(fèi)：副產(chǎn)物積累會(huì)消耗碳源與能量，導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸合成的碳源轉(zhuǎn)化率下降（每積累1g乙酸，PS產(chǎn)量約下降0.8g），同時(shí)酸化發(fā)酵液，抑制細(xì)胞活性。

二、磷脂酰絲氨酸發(fā)酵關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)調(diào)控策略

1. 碳源代謝流調(diào)控：優(yōu)化供給與分配

節(jié)點(diǎn)1：碳源類型與濃度適配

采用“葡萄糖+甘油”復(fù)合碳源（質(zhì)量比3:1），葡萄糖快速供能，甘油為磷脂合成提供優(yōu)質(zhì)碳骨架，可使磷脂酰絲氨酸合成的碳源轉(zhuǎn)化率提升15%~20%；

初始碳源濃度控制在20~30g/L，發(fā)酵中期通過(guò)補(bǔ)料維持碳源濃度5~10g/L，避免碳源過(guò)量導(dǎo)致乙酸積累，或碳源匱乏引發(fā)代謝流停滯。

節(jié)點(diǎn)2：EMP-TCA循環(huán)通量強(qiáng)化

過(guò)表達(dá)6-磷酸果糖激酶（PFK）與異檸檬酸脫氫酶（IDH），提升碳源向TCA循環(huán)的流入效率，增加ATP與NADH供給；

添加0.1~0.3mmol/L Mg²⁺，激活丙酮酸脫氫酶（PDH），減少丙酮酸向乳酸的分流，使乙酰輔酶A供給量提升25%。

2. 前體PE合成流調(diào)控：定向強(qiáng)化供給

節(jié)點(diǎn)1：補(bǔ)救合成路徑激活

異源表達(dá)大腸桿菌來(lái)源的乙醇胺激酶（EtnK），強(qiáng)化外源乙醇胺的利用效率，發(fā)酵中添加5~10g/L乙醇胺（分3次補(bǔ)加，避免抑制細(xì)胞生長(zhǎng)），使PE產(chǎn)量提升30%~40%；

過(guò)表達(dá)CTP合成酶（PyrG），強(qiáng)化CTP供給，緩解CDP-DAG合成的瓶頸，CTP濃度可提升至原來(lái)的2.3倍。

節(jié)點(diǎn) 2：從頭合成路徑輔助

調(diào)控磷脂酸磷酸酶（PAP）活性，抑制PA向甘油二酯（DG）的轉(zhuǎn)化，維持PA向CDP-DAG的代謝流，可使PE合成的前體供給增加12%；

發(fā)酵中期添加0.5~1g/L不飽和脂肪酸（如油酸），補(bǔ)充磷脂合成的脂肪酸鏈，減少細(xì)胞自身合成負(fù)擔(dān)，間接提升PE合成效率。

3. 目標(biāo)產(chǎn)物磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)化流調(diào)控：提升PSS酶促效率

節(jié)點(diǎn)1：PSS酶活性強(qiáng)化

異源表達(dá)來(lái)源于釀酒酵母或大腸桿菌的PSS基因（如spt14、pssA），并優(yōu)化啟動(dòng)子（如使用 tac 強(qiáng)啟動(dòng)子），使PSS酶活提升3~5倍，磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)化率從野生型的25%提升至60%以上；

維持發(fā)酵液pH6.5~7.0（PSS酶適宜pH），添加0.5mmol/L Mn²⁺，進(jìn)一步激活PSS酶的底物結(jié)合能力。

節(jié)點(diǎn)2：L-絲氨酸濃度調(diào)控

分階段補(bǔ)加L-絲氨酸，發(fā)酵12h后開(kāi)始補(bǔ)加，累計(jì)補(bǔ)加量8~12g/L，維持發(fā)酵液中L-絲氨酸濃度2~3g/L，通過(guò)質(zhì)量作用定律推動(dòng)PE向PS的轉(zhuǎn)化，減少可逆反應(yīng)的代謝流回流。

4. 副產(chǎn)物代謝流調(diào)控：抑制無(wú)效消耗

節(jié)點(diǎn)1：乙酸積累抑制

采用“低溶氧分段控制”：發(fā)酵前期溶氧維持在30%~40%（促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)），中期降至20%~25%（抑制PDH旁路的乙酸生成），同時(shí)補(bǔ)加碳酸氫鈉維持pH6.5~7.0，可使乙酸積累量降低40%；

過(guò)表達(dá)乙酸激酶（AckA）與磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（Pta），促進(jìn)乙酸的再利用，將乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A重新進(jìn)入TCA循環(huán)。

節(jié)點(diǎn)2：PC合成支路阻斷

敲除磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PEMT）基因，阻斷PE向PC的甲基化反應(yīng)，使PE代謝流更多流向磷脂酰絲氨酸合成，其產(chǎn)量可提升10%~15%；

控制培養(yǎng)基中膽堿濃度＜0.1g/L，避免膽堿誘導(dǎo)PC合成支路的激活。

5. 輔酶與能量代謝流調(diào)控：維持代謝平衡

發(fā)酵中期添加0.2~0.4mmol/L NAD⁺前體（如煙酰胺），強(qiáng)化NAD⁺/NADH循環(huán)，為CTP合成、脂肪酸合成等耗能反應(yīng)提供輔酶支持；

控制發(fā)酵溫度：前期（0~12h）37℃（促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)），中期（12~48h）30~32℃（提升PSS 酶穩(wěn)定性與活性），后期（48h后）28℃（減少產(chǎn)物降解），通過(guò)溫度調(diào)控平衡生長(zhǎng)與合成的能量分配。

三、代謝流分析方法與調(diào)控效果評(píng)估

1. 代謝流分析技術(shù)手段

同位素標(biāo)記法：采用¹³C-葡萄糖或¹³C-乙醇胺作為標(biāo)記底物，通過(guò)GC-MS/MS檢測(cè)代謝中間產(chǎn)物（如丙酮酸、乙酰輔酶A、PE、PS）的同位素豐度，量化各路徑的代謝流分配比例；

代謝物組學(xué)分析：利用 HPLC-MS檢測(cè)胞內(nèi)代謝物濃度（如CTP、L-絲氨酸、PE、PS），結(jié)合酶活測(cè)定（PSS、EtnK、PyrG等），定位代謝流瓶頸；

通量平衡分析（FBA）：基于基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型，模擬不同調(diào)控策略下的代謝流分布，預(yù)測(cè)至優(yōu)調(diào)控靶點(diǎn)（如過(guò)表達(dá)PyrG、敲除PEMT）。

2. 調(diào)控效果核心評(píng)價(jià)指標(biāo)

關(guān)鍵指標(biāo)：磷脂酰絲氨酸的產(chǎn)量（目標(biāo)＞10g/L）、磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)化率（PE向PS的轉(zhuǎn)化效率＞60%）、碳源轉(zhuǎn)化率（每克碳源生成PS的量＞0.8g）；

輔助指標(biāo)：副產(chǎn)物含量（乙酸＜2g/L、PC＜1g/L）、細(xì)胞干重（＞15g/L）、發(fā)酵周期（控制在72h內(nèi)）。

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